參考清華大學(xué)盧元教授的文章

《無(wú)細(xì)胞體系非天然蛋白質(zhì)合成研究進(jìn)展》

為什么用cell-free系統(tǒng)（CFUPS）

非天然氨基酸表達(dá)難點(diǎn)：

（1）目標(biāo)蛋白合成途徑非細(xì)胞內(nèi)主反應(yīng)，導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量較低，純化步驟繁瑣；

（2）某些UNAAs不易穿過(guò)細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞，從而降低了細(xì)胞對(duì)UNAAs的利用率，限制UNAAs嵌入效率；

（3）非天然氨基酸的細(xì)胞毒性；

這些導(dǎo)致體內(nèi)UNAAs的嵌入效率較低，特別是在多位點(diǎn)UNAAs嵌入時(shí)尤為明顯。

無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（Cell-free protein synthesis, CFS）是一種在沒(méi)有活細(xì)胞的情況下，利用細(xì)胞提取物進(jìn)行蛋白質(zhì)合成的技術(shù)。這種技術(shù)允許科學(xué)家在體外環(huán)境中合成蛋白質(zhì)，而無(wú)需依賴細(xì)胞的內(nèi)部機(jī)制。隨著技術(shù)的發(fā)展，無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（CFUPS）進(jìn)一步擴(kuò)展了這一概念，允許合成含有非天然氨基酸（UNAAs）的蛋白質(zhì)。

在CFUPS中，使用外源DNA或mRNA作為模板，這些模板編碼的蛋白質(zhì)序列包含非天然氨基酸。然后，將底物、能量物質(zhì)、輔因子和非天然組分添加到反應(yīng)體系中。這些非天然組分包括正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA（o-aaRS/o-tRNA）對(duì)，它們是專門設(shè)計(jì)的酶和tRNA，能夠識(shí)別并結(jié)合非天然氨基酸。在細(xì)胞提取物提供的多種酶的作用下，這些非天然氨基酸被整合到蛋白質(zhì)鏈中，從而合成出含有非天然氨基酸的蛋白質(zhì)。

CFUPS與細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成相比具有諸多的優(yōu)點(diǎn)

2. 怎么做：無(wú)細(xì)胞體系UNAAs嵌入的方法

    在無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)（CFUPS）中，嵌入非天然氨基酸（UNAAs）的方法是實(shí)現(xiàn)非天然蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵。以下是一些主要的嵌入方法，它們?cè)贑FUPS中被廣泛使用：

（1）全局抑制：這種方法通過(guò)使用突變的釋放因子（release factors）或tRNAs來(lái)抑制正常的終止密碼子，使得翻譯過(guò)程在遇到終止密碼子時(shí)不會(huì)停止，而是繼續(xù)添加非天然氨基酸。

（2）終止密碼子抑制：這種方法利用特定的突變釋放因子，它們能夠識(shí)別終止密碼子，但不會(huì)終止翻譯過(guò)程，而是允許非天然氨基酸的插入。

（3）移碼抑制：這種方法通過(guò)改變mRNA的讀取框架來(lái)實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的嵌入。通過(guò)特定的策略，如使用特定的tRNAs或突變的tRNAs，可以在特定的位置插入非天然氨基酸，而不影響蛋白質(zhì)的其余部分。

（4）有義密碼子再分配：這種方法涉及將一個(gè)原本編碼天然氨基酸的密碼子重新分配給非天然氨基酸。這通常通過(guò)使用突變的tRNAs來(lái)實(shí)現(xiàn)，這些tRNAs能夠識(shí)別特定的有義密碼子，并將非天然氨基酸添加到蛋白質(zhì)鏈中。

（5）非天然堿基對(duì)：這種方法通過(guò)擴(kuò)展遺傳密碼來(lái)實(shí)現(xiàn)非天然氨基酸的嵌入。通過(guò)引入新的堿基對(duì)，可以編碼更多的氨基酸，包括非天然氨基酸。這通常涉及到使用經(jīng)過(guò)工程改造的聚合酶和tRNAs。

    這些方法的發(fā)展和應(yīng)用，使得科學(xué)家能夠在蛋白質(zhì)合成過(guò)程中精確地控制非天然氨基酸的位置，從而為蛋白質(zhì)工程和藥物設(shè)計(jì)提供了新的工具。

3. 非天然氨基酸蛋白有什么用？

無(wú)細(xì)胞蛋白合成系統(tǒng)（CFUPS）在合成具有特定功能的非天然蛋白質(zhì)方面取得了顯著進(jìn)展，并在多個(gè)領(lǐng)域展現(xiàn)出其重要性和應(yīng)用潛力。以下是一些主要的應(yīng)用領(lǐng)域：

（1）蛋白藥物合成：CFUPS可以用于合成具有治療潛力的蛋白質(zhì)藥物，包括抗體、酶和激素等。通過(guò)在蛋白質(zhì)中嵌入非天然氨基酸，可以提高藥物的穩(wěn)定性、延長(zhǎng)半衰期或增強(qiáng)其生物活性。

（2）病毒樣顆粒（Virus-like particles, VLPs）：VLPs是模仿病毒結(jié)構(gòu)的納米級(jí)顆粒，但不含病毒遺傳物質(zhì)，因此不具有傳染性。CFUPS可以用于合成VLPs，這些顆粒在疫苗開(kāi)發(fā)和藥物遞送系統(tǒng)中具有應(yīng)用潛力。

（3）膜蛋白合成：膜蛋白在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)和能量轉(zhuǎn)換等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CFUPS可以用于合成具有特定功能的膜蛋白，這有助于研究其結(jié)構(gòu)和功能，以及開(kāi)發(fā)針對(duì)這些蛋白的藥物。

（4）蛋白質(zhì)材料：CFUPS可以用于合成具有特定物理或化學(xué)性質(zhì)的蛋白質(zhì)材料，這些材料可以用于組織工程、生物傳感器或納米技術(shù)等領(lǐng)域。

（5）蛋白質(zhì)間相互作用研究：CFUPS提供了一種工具，用于研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，這對(duì)于理解細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和開(kāi)發(fā)新的干預(yù)策略至關(guān)重要。

（6）開(kāi)發(fā)新型蛋白材料：通過(guò)CFUPS合成的非天然蛋白質(zhì)可以被設(shè)計(jì)成具有特定的結(jié)構(gòu)和功能，用于開(kāi)發(fā)新型的生物材料，這些材料可能具有的機(jī)械性能或生物相容性。

4. 后續(xù)開(kāi)發(fā)方向

將來(lái)無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)需要朝著4個(gè)方面發(fā)展，分別是：1)開(kāi)發(fā)更有效的OTSs，提高非天然氨基酸的嵌入效率；2)實(shí)現(xiàn)在目標(biāo)蛋白的多個(gè)位點(diǎn)嵌入多種UNAAs，擴(kuò)大非天然蛋白質(zhì)的種類；3)解決UNAAs多樣性帶來(lái)的生物不相容性，使非天然蛋白質(zhì)的產(chǎn)量得到大幅度的上升；4)進(jìn)一步降低非天然蛋白質(zhì)合成的成本，使其能夠帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益，促進(jìn)工業(yè)化應(yīng)用。最大限度去開(kāi)發(fā)無(wú)細(xì)胞非天然蛋白質(zhì)合成平臺(tái)的潛力，使其能夠更好地應(yīng)用于科學(xué)基礎(chǔ)研究及工業(yè)生產(chǎn)研究。

挑戰(zhàn)（Challenges）

• UNAA嵌入位點(diǎn)的選擇：選擇合適的非天然氨基酸（UNAA）嵌入位點(diǎn)。

• 多位點(diǎn)UNAA嵌入：實(shí)現(xiàn)在蛋白質(zhì)中多個(gè)位點(diǎn)嵌入U(xiǎn)NAAs。

• 與內(nèi)源元素的交叉反應(yīng)：避免與細(xì)胞內(nèi)源性成分的反應(yīng)。

• UNAA嵌入效率低：提高UNAA嵌入的效率。

• 困難的核糖體工程：改進(jìn)核糖體工程以適應(yīng)非天然氨基酸的合成。

• 缺乏可擴(kuò)展的系統(tǒng)：開(kāi)發(fā)可大規(guī)模應(yīng)用的CFUPS系統(tǒng)。

• 高成本：降低CFUPS系統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)成本。

• 耗費(fèi)時(shí)間和勞動(dòng)力：減少制備、純化和分析過(guò)程中的時(shí)間和勞動(dòng)力消耗。

潛在改進(jìn)（Potential improvements）

• 開(kāi)發(fā)非天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)折疊預(yù)測(cè)算法：幫助預(yù)測(cè)UNAAs嵌入后蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。

• 開(kāi)發(fā)無(wú)需純化的高通量篩選方法：簡(jiǎn)化篩選過(guò)程，提高效率。

• 篩選更多正交翻譯對(duì)：增加可用于UNAA嵌入的正交氨酰tRNA合成酶/正交tRNA對(duì)。

• 加速開(kāi)發(fā)移碼抑制、有義密碼子再分配和非天然堿基對(duì)方法：推動(dòng)這些嵌入技術(shù)的發(fā)展。

• 進(jìn)化正交翻譯對(duì)：通過(guò)進(jìn)化生物學(xué)方法改進(jìn)正交翻譯對(duì)的性能。

• 工程化底盤生物：通過(guò)基因工程改造底盤生物以適應(yīng)CFUPS系統(tǒng)。

• 優(yōu)化CFUPS系統(tǒng)的成分組成：調(diào)整反應(yīng)體系以提高UNAA嵌入效率。

• 發(fā)展體外核糖體進(jìn)化平臺(tái)：用于改進(jìn)核糖體以適應(yīng)非天然氨基酸的合成。

• 模仿標(biāo)準(zhǔn)生物反應(yīng)器配置：在大規(guī)模生產(chǎn)中應(yīng)用CFUPS系統(tǒng)。

• 簡(jiǎn)化產(chǎn)品分析方法：減少分析過(guò)程中的復(fù)雜性。

• 自行合成試劑：包括UNAAs、tRNAs等，以降低成本。

• 優(yōu)化能量供給系統(tǒng)：改進(jìn)CFUPS系統(tǒng)中的能量供應(yīng)。

• 優(yōu)化細(xì)胞提取物、表達(dá)模板和OTS組分的制備：提高制備過(guò)程的效率和成本效益。

• 簡(jiǎn)化制備過(guò)程：減少制備過(guò)程中的時(shí)間和勞動(dòng)力消耗。

• 簡(jiǎn)化純化和分析過(guò)程：提高純化和分析的效率。